題目：人心房成纖維細胞對基質(zhì)剛度異質(zhì)性的適應(yīng)

（如果需要完整文獻請與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）

摘要：纖維化與衰老和許多心臟病有關(guān)。其特征在于肌成纖維細胞分化和細胞外基質(zhì)蛋白的過度積累。纖維化相關(guān)的組織重塑導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和功能的顯著變化，包括被動機械性能。隨著最近開發(fā)的新工具和方法，該研究領(lǐng)域獲得了顯著的發(fā)展，以更好地表征和理解細胞感知和響應(yīng)其生物物理環(huán)境的能力。我們使用一種稱為CyPhyGel的新型水凝膠來提供與重塑相關(guān)的組織硬度變化的*體外模型。基于藍藻光敏色素的光控二聚化，它能夠以高空間和時間分辨率對水凝膠機械性能進行非接觸式和可逆調(diào)諧。在CyPhyGels上培養(yǎng)人原代心房成纖維細胞。在硬質(zhì)（~4.6 kPa）或軟質(zhì)（~2.7 kPa）CyPhyGels上培養(yǎng)4天后，我們分析了成纖維細胞面積和硬度。與在較硬的基質(zhì)上生長的細胞相比，在較軟的基質(zhì)上生長的細胞更小更軟。當(dāng)軟質(zhì)和硬質(zhì)生長底物組合在單個CyPhyGel中時，不存在這種差異，產(chǎn)生的細胞面積與均質(zhì)剛性凝膠上的細胞面積相似，細胞剛度與均質(zhì)軟基質(zhì)上的細胞剛度相似。使用CyPhyGels在體外模擬組織硬度異質(zhì)性，我們的結(jié)果證實了心臟成纖維細胞適應(yīng)其機械環(huán)境的能力，并表明存在一種旁分泌機制，該機制可以調(diào)整與機械誘導(dǎo)的表型向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的成纖維細胞結(jié)構(gòu)和功能特性。在局部組織硬度增加的情況下，例如在瘢痕形成或彌漫性纖維化時，這種機制可以幫助防止正常組織和患病組織之間邊界區(qū)域的細胞特性突然變化。CyPhyGeles的光可調(diào)機械性能及其對研究人類原代心臟細胞的適用性使其成為心臟力學(xué)生物學(xué)研究的有吸引力的模型系統(tǒng)。進一步的研究將探索生物物理和可溶性因素在心臟成纖維細胞對空間和時間異質(zhì)機械線索的反應(yīng)中的相互作用。

一、介紹

由于衰老、機械超負荷或損傷等原因引起的心臟組織損傷與纖維化的發(fā)展有關(guān)。纖維化的特征在于肌成纖維細胞分化和細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的過度積累（Herum等人，2017）。這種重塑主要是由成纖維細胞驅(qū)動的（Manabe等人，2002;Travers等人，2016），組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)的變化，其后果從心輸出量受損到心律失常脆弱性增加（Nguyen和Qu，2014）。最終，纖維化的存在和程度是心臟性猝死的主要危險因素（Disertori等人，2016）。到目前為止，還沒有有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)心臟纖維化，主要是由于對潛在的基本機制了解不足。

可能的治療方法必須考慮組織力學(xué)的變化，這既是重塑的原因，也是重塑的結(jié)果。成纖維細胞對其機械環(huán)境的感知已被證明在纖維化重塑中發(fā)揮作用（Hinz，2013;范普滕等人，2016 年）。近年來，已經(jīng)開發(fā)了幾種體外模型來研究成纖維細胞機械傳感。這些模型中的主要一類使用合成基材，包括水凝膠和有機硅。這些允許研究人員規(guī)定培養(yǎng)細胞的機械環(huán)境（Rosales和Kristi，2016;李等人，2018）?；蛘撸烊淮嬖诘牡孜?，如脫細胞組織（Ott等人，2008）或活的心臟組織切片（Perbellini等人，2018）已被用于為細胞提供近生理生長底物，但這些是更復(fù)雜且可重復(fù)性較差的模型。更接近地模擬體內(nèi)條件的底物是的，因為當(dāng)ECM生產(chǎn)克服退化時，纖維化組織的整體剛度提高（Levental等人，2010），剛度分布是高度異質(zhì)的。具有或多或少ECM的區(qū)域構(gòu)成了不同的機械微域。在彌漫性纖維化中，例如在心房顫動中，僵硬的ECM島分布在較軟的組織中（Tanaka等人，2007）。鑒于對單細胞的機械效應(yīng)主要由其微環(huán)境主導(dǎo)，體外模型應(yīng)復(fù)制這些剛度異質(zhì)性，理想情況下以可控的方式。

允許在機械性能中引入空間梯度的模型已被用于證明成纖維細胞的剛度引導(dǎo)遷移，這一過程稱為durotaxis，取決于基質(zhì)蛋白的類型（Hartman等人，2017）。此外，具有微圖案剛性和軟區(qū)域的水凝膠用于顯示細胞在各種剛度上的適應(yīng)性（Sunyer等人，2012），并研究基質(zhì)組織對間充質(zhì)干細胞分化的作用（Yang等人，2016）。然而，這些模型不允許人們在時間或空間上動態(tài)和可逆地改變生長基質(zhì)的被動機械性能。基于藍藻光敏色素Cph1的新型水凝膠系統(tǒng)（我們在這里稱為CyPhyGel）可以通過允許水凝膠硬度的光控，可逆變化來解決這一限制（H?rner等人，2019b）。為此，使用細胞兼容的紅光在其單體（740nm）或二聚體（660nm）形式之間切換Cph1，從而分別以非接觸方式減少或增加生長基質(zhì)中的交聯(lián)數(shù)量。CyPhyGels的剛度可以在1.5和5.5 kPa（有效楊氏模量）之間變化。剛度的變化發(fā)生在照明的幾秒鐘內(nèi)，是可分級的，在沒有光線的情況下是穩(wěn)定的，并且是可逆的（H?rner等人，2019b）。在這項研究中，我們使用CyPhyGels來研究人類心臟成纖維細胞對杜羅抗性以外機械環(huán)境剛度異質(zhì)性的適應(yīng)。

二、材料和方法

CyPhyGels和成纖維細胞的納米壓痕

有效楊氏模量，E伊芙，使用Chiaro納米壓痕系統(tǒng)（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）進行評估。連接到校準懸臂上的球形用于壓痕樣品，同時將激光束照射到反射懸臂表面上。對反射的激光進行干涉分析，以測量與懸臂彎曲相關(guān)的相移。由此計算出樣品壓痕所需的力。E伊芙使用接觸力學(xué)的赫茲模型推導(dǎo)（赫茲，1881;陳，2014）假設(shè)不可壓縮材料的泊松比為0.5，通常用于細胞和組織的機械測試（圖1B;Guz 等人，2014 年）。在整份手稿中，E伊芙稱為剛度。以5 μm/s的置換速度進行2–4 μm的樣品壓痕。數(shù)據(jù)分析使用 Optics11 DataViewer （V2.0.27）。

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對于CyPhyGel表征，使用了彈簧常數(shù)為0.45–0.5 N/m且半徑為20–23 μm的懸臂。對于細胞評估，使用彈簧常數(shù)為0.01-0.02 N/m的懸臂和半徑為3-3.5μm的。通過在兩到三個與細胞核不重疊的不同位置進行表面法向壓痕來確定單個細胞的剛度。對于每個壓痕，使用赫茲模型來擬合從初始細胞表面接觸到1μm壓痕的力 - 位移曲線，以避免來自底層生長基質(zhì)的機械干擾。在接種CyPhyGels后4天評估細胞硬度。

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結(jié)果

通過光調(diào)節(jié)CyPhyGels的機械性能

均勻暴露在660 nm照明下的CyPhyGels具有E伊芙4.59 ± 0.11 kPa，而用 740 nm 照明后，E伊芙分別為 2.72 ± 0.06 kPa（圖 2A，）。相似的最大值和最小值 E伊芙發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)CyPhyGels的兩個差異調(diào)諧的一半。為了對剛度梯度進行空間表征，以50μm的步長繪制了異質(zhì)CyPhyGels，沿著垂直于其剛性和軟性兩半之間邊界的線繪制。E伊芙從 4.48 ± 0.58 變?yōu)?2.12 ± 0.30 kPa（圖 2C）。在邊界附近使用更高分辨率的步長（5μm），我們發(fā)現(xiàn)剛性和軟區(qū)域之間的過渡發(fā)生在100-150μm的寬帶內(nèi)（圖2D）。邊界區(qū)域的寬度至少在1毫米以上是恒定的（補充圖S3）。

圖2

圖2.CyPhyGels的機械性能。（A）本實驗中使用的CyPhyGel配置的示意圖。（二）E伊芙的CyPhyGels，暴露于660或740nm（n = 24）的均勻照明或順序照明，因此機械異質(zhì)（n = 4），通過納米壓痕測定。（三） E伊芙沿著垂直于三個代表性異質(zhì)CyPhyGels的剛性和軟性兩半之間邊界的軸，說明了凝膠剛度的階躍變化（連續(xù)測量點之間的距離為50μm，n = 3）。（D）從圖C對凝膠3中的過渡區(qū)域進行更高分辨率的評估（測量點之間的距離為5μm）。（E） E伊芙在照明后（第0天）和6天后立即從圖C獲得凝膠3，對應(yīng)于實驗的持續(xù)時間。

為了評估CyPhyGel剛度的異質(zhì)性是否隨時間推移而持續(xù)，在順序照明后6天測量了剛度，這對應(yīng)于實驗的持續(xù)時間。具有不同剛度的兩個區(qū)域仍然清晰可辨（圖2E）。6天內(nèi)柔軟區(qū)域的硬度略有增加是由于在CyPhyGel處理和細胞培養(yǎng)過程中暴露于外部光線（補充圖S2）。

結(jié)論

我們提出了一種新的體外模型，適用于研究對基質(zhì)剛度局部和時間變化的動態(tài)生物學(xué)反應(yīng)。該模型將用于闡明不同機械微環(huán)境中細胞之間的通信機制，例如模擬纖維化或瘢痕性心肌。我們的結(jié)果表明，心臟成纖維細胞對生長基質(zhì)機械特性的適應(yīng)可以通過旁分泌因子以及直接的細胞 - 細胞接觸來調(diào)節(jié)。

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生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動平臺上極其敏銳的壓痕探頭
1.壓痕移動平臺，具備粗進以及精進兩級移動精度，使得探針可以自動尋找到表面并且提供高精度壓痕。除了壓痕移動平臺，Piuma納米壓痕儀還有一個手動樣品移動平臺
2.方便樣品的安放。你的樣品可以放在X-Y移動臺上Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

3.進行楊氏模量的測試或者進行多點陣測試。一個內(nèi)置式的顯微鏡
4.可以直接觀察實驗過程！Piuma Nanoindenter微納壓痕儀廠商

生物組織納米壓痕儀是一個簡單易用的革命性產(chǎn)品，為軟物質(zhì)以及生物材料組織的微觀以及納觀研究帶來希望。依靠自身*的新型光學(xué)技術(shù)以及杰出的微加工工藝，Piuma納米壓痕儀可以測量楊氏模量軟的樣品，范圍甚至是從5Pa到5GPa!Piuma同樣非常適合在液體中測試樣品。其操作非常簡單易學(xué)，只需將探頭插入儀器中，簡單定標后，即可馬上開始壓痕實驗。

產(chǎn)品構(gòu)件詳細介紹：
1.PROBE探頭
納米壓痕儀核心:一個微加工工藝制作的光學(xué)壓痕探頭
2.SAMPLE樣品
從水凝膠到骨組織等，在大氣中或者浸沒在液體中
3.SAMPLEXYSTAGEXY樣品臺
在X-Y（12x12mm）范圍內(nèi)測試樣品
4.INDENTATIONSTAGE壓痕移動臺
粗進以及精進移動臺實現(xiàn)精確壓痕以及自動尋找樣品表面
5.MANUALSTAGE手動平臺
為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間

納米以及微米級別的生物機械性能

Piuma是一個創(chuàng)新的，具有成本效益的工具，用來表征生物材料、組織、細胞器、細胞層、軟骨、靜電支架、力學(xué)性能，3D打印材料，水凝膠等的微納米機械性能。

The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求，提供易用性和便攜性，同時提供高精度、高通量和多樣化的數(shù)據(jù)。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭，特別適合在液體中測量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究者，Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個解決方案。 

軟物質(zhì)材料表征

在生物材料、組織工程、再生醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，Piuma可以在溶液里進行非破壞性測量測量某點或者某個區(qū)域的楊氏模量、蠕變和松弛實驗，點陣測量粘附力，描述應(yīng)變硬化行為，樣品的粘度等。測試生物材料和組織樣本的軟硬度可以很容易地在Piuma納米壓痕儀上用其optics11 PIUMA探頭和專用的Piuma軟件來實現(xiàn)。 

Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應(yīng)用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細胞等軟物質(zhì)以及生物材料的機械性能研究。采用了新型探頭設(shè)計，彌補了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無法測試軟物質(zhì)的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質(zhì)測試中的數(shù)據(jù)波動大，操作困難、制樣嚴苛等常見問題。更開創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動態(tài)力學(xué)測試模式DMA，可以獲得材料與振動頻率相關(guān)的儲存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學(xué)損耗。