題目：上皮和基質(zhì)角膜硬度的變化隨年齡和肥胖而發(fā)生

（如果需要完整文獻(xiàn)請與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）

簡介：

角膜是無血管的，這使其成為研究基質(zhì)蛋白表達(dá)和組織硬度的模型。角膜上皮粘附在基底區(qū)，下面的基質(zhì)由角質(zhì)細(xì)胞和廣泛的膠原蛋白和蛋白聚糖基質(zhì)組成。我們的目標(biāo)是檢查8周和15周小鼠的角膜變化，并將其與15周前2型糖尿病肥胖小鼠進(jìn)行比較。對角膜上皮進(jìn)行納米壓痕原位，然后對上皮進(jìn)行磨損，并在基底膜和基質(zhì)上重復(fù)該過程。進(jìn)行共聚焦成像以檢查蛋白質(zhì)的定位。發(fā)現(xiàn)僵硬取決于年齡和肥胖。與8周小鼠相比，15周小鼠上皮的楊氏模量更大。在15周時，對照組的上皮明顯大于肥胖小鼠的上皮。Crb3和PKCζ在頂端上皮的定位存在差異，肥胖小鼠缺乏片狀延伸。在2型前糖尿病肥胖小鼠中，硬度斜率存在差異，損傷后纖連蛋白的定位可以忽略不計。這些表明，飲食引起的年齡和環(huán)境變化會隨著年齡的增長而改變組織的完整性，使其更僵硬。來自2型前糖尿病肥胖小鼠的角膜明顯較軟，這可能是由于頂端表面蛋白質(zhì)的變化表明缺乏完整性和纖連蛋白減少。

2. 材料和方法

2.3. 納米壓痕

角膜上皮和基質(zhì)硬度用Piumanano壓痕系統(tǒng)（Optics11，阿姆斯特丹，荷蘭）測量。為了進(jìn)行測量，頭部被固定。將眼睛浸入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并將探針降低到角膜的中心。探頭的半徑為26μm，剛度為4.4 N / m。通過10μm壓痕進(jìn)行上皮測量。

為了檢查基底膜和基質(zhì)，對上皮進(jìn)行了磨損。使用各種壓痕深度進(jìn)行測量，范圍從1μm到17μm。使用基于赫茲接觸力學(xué)模型的內(nèi)置PIUMA軟件計算樣品的楊氏模量，假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。加載曲線通過軟件擬合到以下方程中：其中F表示施加的力，表示有效楊氏模量，表示球尖半徑，并表示壓痕深度。我們用于分析的體積楊氏模量是使用以下公式生成的：其中表示被測材料的泊松比。

3. 結(jié)果

3.1. 僵硬取決于年齡和肥胖

在接下來的實驗中，我們將8周和15周的小鼠與天然發(fā)生的小鼠肥胖模型（2型糖尿病小鼠前）進(jìn)行了比較，以檢查上皮和基質(zhì)硬度的變化。使用來自5只8周對照小鼠，5只15周對照小鼠和2只DiO 15周齡小鼠的雙眼。之前，我們證明了肥胖小鼠角膜的角膜上皮傷口修復(fù)受損[。這些結(jié)果刺激我們檢查角膜的變化，這可能是細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)變化的根本原因。在中，我們檢查了完整眼睛中上皮，基底膜和基質(zhì)的硬度。計算Young氏模量，15周C57Bl6小鼠的完整角膜上皮顯著大于8周小鼠的完整角膜上皮（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0.01）。在同等年齡時，上皮顯著大于年齡匹配的DiO小鼠角膜（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0. 01）。在這里，小鼠的背景相似，DiO小鼠被喂食高脂肪飲食15周。

圖1.8周對照的角膜上皮硬度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。

4.4. 討論

角膜是的，因為它作為眼睛的折射表面發(fā)揮著基本功能，同時也在眼睛和外部環(huán)境之間保持了不透水的屏障。我們已經(jīng)表明，僵硬的變化隨著年齡的增長以及肥胖小鼠（DiO）而發(fā)生，這是II型糖尿病前期的模型。之前，我們證明了DiO小鼠的角膜愈合速度明顯慢于對照C57BL6小鼠的角膜[]。我們在本手稿中的數(shù)據(jù)支持一份報告，即與對照組相比，糖尿病前期患者的角膜表面疾病發(fā)病率增加（分別為20.67%和3.33%;p < 0.05） []。

我們證明，年齡匹配的動物的上皮硬度與年齡和飲食有關(guān)。由于DiO動物的上皮不那么堅硬，我們反映了上皮完整性的變化，并對頂端上皮中常見的極性蛋白進(jìn)行了染色。我們檢查了未受傷和受傷的角膜，因為平面極性可以通過幾種不同的線索引發(fā)，包括生長因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)的變化]。這些線索被認(rèn)為被轉(zhuǎn)化為定向遷移，這需要通過信號通路重組細(xì)胞成分。這些蛋白質(zhì)通常局限于遷移細(xì)胞的前部，導(dǎo)致細(xì)胞骨架變化，前緣膜突起和定向運動[這些變化在對照中觀察到，并在DiO角膜中被修改。先前，在其他組織中發(fā)現(xiàn)Crb3在分化的分泌細(xì)胞和分化的纖毛細(xì)胞中定位于頂端表面]。

在基底膜和基質(zhì)中也檢測到剛度的差異，通過基質(zhì)的剛度變化百分比發(fā)生變化。所有測量均在中央角膜中進(jìn)行。剛度變化的原因尚不清楚[]。表明隨著年齡的增長，結(jié)締組織的特征是晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的積累，并且糖尿病患者受其積累的影響更大。這很重要，因為它可以改變基質(zhì)中豐富的蛋白質(zhì)（如膠原蛋白）的糖基化。他們對體外肌腱的研究表明，AGEs會降低組織的粘彈性。關(guān)于AGEs隨時間積累及其對膠原纖維和蛋白聚糖間距的影響的數(shù)據(jù)尚不清楚。

在最近的一篇綜述中，McKay等人指出，膠原蛋白交聯(lián)提供了維持角膜完整性的強度，衰老和糖尿病與膠原交聯(lián)的增加有關(guān)[]。然而，該評價隨后指出，雖然糖尿病人群的角膜滯后和角膜阻力因子升高，但存在不一致之處，他們提出這是由于人類患者群體的異質(zhì)性。糖尿病人群中的一致性極難控制，原因包括疾病的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間。出于這個原因，隨著時間的推移，對幾種不同的小鼠糖尿病模型的研究將很有趣，以解決這個問題。McKay確實報告了基質(zhì)厚度增加，根據(jù)研究的不同，剛度沒有或中度增加。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)DiO角膜Kneer等人（2018）的基質(zhì)厚度增加。

其他研究者假設(shè)這種增加與糖尿病有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在其隊列中，LOX與糖尿病或肥胖無關(guān)[]。雖然我們測量了僵硬，但我們沒有測量LOX，需要在飲食的不同時間在DiO小鼠中檢查其表達(dá)。事實上，他們的體外研究表明，升高的LOX與缺氧的關(guān)聯(lián)更大。此外，Mankus等人（2012）在P2X7敲除小鼠中證明，LOX與III型膠原蛋白一樣升高，并不表示交聯(lián)增加[]。然而，在DiO小鼠和糖尿病人角膜中，P2X7 mRNA顯著升高7-10倍[。這種升高表達(dá)的功能含義尚不清楚。在我們目前的研究中，沒有進(jìn)行膠原纖維測量，未來的研究將進(jìn)一步檢查基質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)。蛋白聚糖的硫酸化可能會發(fā)生變化，因為這也可能影響剛度。

我們的研究表明，DiO角膜傷口愈合受損可能反映了硬度的差異或基質(zhì)分子（如纖連蛋白）的變化。在對照中，與DiO角膜相比，沿著基質(zhì)神經(jīng)和對照前緣檢測到纖連蛋白。缺氧角膜中檢測到纖連蛋白減少，與對照組相比，角膜愈合延遲[]。甚至有可能缺乏順應(yīng)性反映了纖連蛋白的減少，因為體外研究表明，纖連蛋白的拉伸會導(dǎo)致其展開，導(dǎo)致隱秘結(jié)合位點暴露[。納米壓痕儀在不同年齡和環(huán)境壓力下對相同背景的小鼠的使用為具有許多相互矛盾數(shù)據(jù)的領(lǐng)域提供了對照研究，因為人類模型非常復(fù)雜。隨著時間的推移，將對肥胖和非肥胖小鼠的2型糖尿病模型進(jìn)行其他研究，以進(jìn)一步測試我們的結(jié)果。識別改變角膜完整性的特定因素將用于治療和預(yù)防變化?？傊?，研究角膜的物理特征，如原位僵硬，可以深入了解控制和患病條件下傷口修復(fù)的機制。

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