一、前言

   面部創(chuàng)傷（例如嚴(yán)重?zé)齻┗蚰[瘤切除術(shù)后耳鼻的重建可能具有挑戰(zhàn)性，特別是當(dāng)軟骨框架受損時。然后，自體軟骨移植物通常與皮瓣聯(lián)合使用，例如鼻子的前額皮瓣或耳朵的脾氣膜筋膜瓣。然而，軟骨移植物的供體部位可能有限，并且總是存在一定量的供體部位發(fā)病率。1特別是，軟骨結(jié)構(gòu)（如耳朵或鼻翼）的重建仍然是一個挑戰(zhàn)，因為它們復(fù)雜的三維形狀和對軟骨特征的高要求。2軟骨結(jié)構(gòu)的彈性特性不僅與臨床結(jié)果相關(guān)，而且與更基礎(chǔ)的研究有關(guān)。

   從臨床醫(yī)生的角度來看，人們傾向于關(guān)注移植組織的大規(guī)模力學(xué)。為了確定這一點，通常執(zhí)行粗機(jī)械測試。例如，由Britt等人測量耳軟骨和組織工程軟骨的拉伸性能。3通過將增量拉伸載荷施加到啞鈴形的軟骨切口上。羅伊等人提出了另一種方法4誰比較了安裝在機(jī)械光譜儀中的3點彎曲裝置中的天然，工程耳骨和肋軟骨。壓縮載荷實驗通常由受限壓縮或壓痕組成。5，6拉伸或壓縮測量都有其優(yōu)點和局限性。7然而，它們都有一個關(guān)鍵的局限性，即上述方法僅提供總解剖學(xué)尺度上的信息。目前，許多研究小組正在探索不同面部組織的再生醫(yī)學(xué)和組織工程的可能性。例如，組織工程耳軟骨可能是克服組織移植問題的一種選擇，例如供體部位的發(fā)病率。8從手術(shù)的角度來看，上述機(jī)械測試很重要，因為我們需要足夠強(qiáng)度的材料，以便在覆蓋肌肉和皮膚時保持形狀。然而，為了設(shè)計用于（軟骨）組織再生的適當(dāng)支架，關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）水平的更詳細(xì)的機(jī)械信息至關(guān)重要。

   組織工程的關(guān)鍵是為再生細(xì)胞保持其表型并形成新組織創(chuàng)造適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。ECM是組織形式和功能的基礎(chǔ)。9耳軟骨ECM由膠原束，彈性蛋白纖維和糖胺聚糖的復(fù)雜混合物組成，每種都對組織的機(jī)械性能具有特定的影響。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞非常容易受到其環(huán)境的機(jī)械特性的影響。10，11因此，支架的剛度對細(xì)胞行為和命運有重要影響。12–14從而在結(jié)構(gòu)作為一個整體的機(jī)械特性上。為了形成正確的組織，支架必須與受損組織的原始硬度緊密匹配。因此，關(guān)于微尺度ECM生物力學(xué)的特定空間信息對于臨床成功至關(guān)重要;隨著時間的推移，我們需要能夠在細(xì)胞（微觀）水平上監(jiān)測組織工程結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能。再生軟骨將隨著新的ECM組件和結(jié)構(gòu)的發(fā)展而發(fā)生機(jī)械變化，支架退化并被替換。因此，在原子力顯微鏡（AFM）和大機(jī)械測試之間，在微觀尺度上對組織工程和移植結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評估對于再生醫(yī)學(xué)的未來臨床實施至關(guān)重要。為了解決這個問題，我們測試了一種商用壓痕器件（Piuma Nanoindenter;Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）能夠在適當(dāng)?shù)奈⒊叨壬线M(jìn)行測量。該系統(tǒng)基于套圈頂懸臂探頭12其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)在不同領(lǐng)域得到證明。13，14在這里，我們擴(kuò)展了這一系列研究，以評估其使用反向組織工程模型監(jiān)測耳軟骨再生隨時間變化的適用性。

   軟骨對機(jī)械力的響應(yīng)受2種機(jī)制的影響：流體動力學(xué)和ECM結(jié)構(gòu)本身的變化。5糖胺聚糖通過吸引水分和使?jié)B透壓積聚而形成ECM的重要組成部分。15彈性蛋白纖維的分布和機(jī)械功能是耳軟骨所有的。16它們對耳朵特定機(jī)械性能的貢獻(xiàn)使得在植入工程軟骨時，它們已經(jīng)充分形成至關(guān)重要。相反，去除這些成分中的任何一個都會定性地影響軟骨。我們設(shè)計了一個耳軟骨組織模型，以反向方式模擬支架隨時間推移的發(fā)展。通過對這些組分中的任何一種進(jìn)行特定的酶降解，我們創(chuàng)建了一個客觀的研究模型，以測試壓頭是否能夠在非破壞性物質(zhì)中以適當(dāng)?shù)某叨葴?zhǔn)確測量ECM的各種結(jié)構(gòu)組分之間的差異。隨著人們的廣泛關(guān)注和最近的進(jìn)展，例如用于組織再生的3維生物打印機(jī)，從頭到尾監(jiān)測發(fā)育組織的機(jī)械質(zhì)量的能力對于在臨床上實施這些新型組織工程方法至關(guān)重要。

二、方法

   （1）樣品制備

   耳軟骨是在附近屠宰場從2至3歲的荷蘭奶山羊單側(cè)獲得的。耳朵（n = 9）被運送到冰上的實驗室，在那里±2厘米2從每個耳朵的基部取出大小大小的軟骨樣本。將樣品進(jìn)一步橫向分成三個5mm高的部分，并用一層薄薄的氰基丙烯酸酯（超級）膠水固定在玻璃顯微鏡載玻片上。新鮮測量每個耳樣品的橫向平面，然后將相同的樣品在37°C的磷酸鹽緩沖鹽水中孵育，以便在24和48小時測量。其他2個樣品以類似的孵育方式進(jìn)行，但分別加入1%的透明質(zhì)酸酶或彈性蛋白酶溶液（均來自密蘇里州圣路易斯的Sigma Aldrich）以除去糖胺聚糖或彈性蛋白。

  （2）縮進(jìn)設(shè)置

      使用商用納米壓痕儀（Piuma;光學(xué)11）。該儀器能夠通過壓痕局部測定樣品在空氣和液體環(huán)境中的機(jī)械性能。它采用套圈頂懸臂探頭8，22施加負(fù)載，同時使用基于光纖的讀數(shù)測量壓痕深度。由此產(chǎn)生的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖.（圖1A）1A）使用Oliver和Pharr描述的模型進(jìn)行分析17，23用于球形壓頭，以確定有效的楊氏模量 （E*）。使用合適的探頭進(jìn)行設(shè)置，能夠施加0.1至7.5 μN的力。在每個系列實驗之前，通過縮進(jìn)剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來執(zhí)行懸臂彎曲校準(zhǔn)。在許多方面，這種設(shè)置可與AFM相媲美。然而，與大多數(shù)通常在亞細(xì)胞（納米）范圍內(nèi)起作用的AFM相反，這種設(shè)置也能夠在細(xì)胞和組織范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

圖 1.

A、軟骨測量的壓痕曲線。切線（紅色）表示用于確定有效楊氏模量的卸載曲線的斜率。B，壓頭的圖形細(xì)節(jié)：球形成壓頭（? = 78μm）。

   （3）壓痕探頭

   使用直徑為78μm，剛度為80 N /m的球形壓頭來接觸面積，并將壓痕過程中的組織損傷降至（圖.（圖1B）。1B）.為了進(jìn)一步增加與的接觸面積，通過使用設(shè)置的全壓痕深度（20μm）使壓痕深度。

   （4）縮進(jìn)協(xié)議

    壓痕協(xié)議經(jīng)過精心優(yōu)化，以最大限度地減少影響測量的粘彈性效應(yīng)。使用2秒加載周期，2秒保持期和4秒卸載周期，可以精確確定曲線角系數(shù)。

   （5）壓痕實驗

   在實驗過程中將樣品浸沒在磷酸鹽緩沖鹽水中，以防止脫水并最大限度地減少壓頭和組織表面之間的粘合力。在準(zhǔn)備實驗（未顯示數(shù)據(jù)）中，沒有發(fā)現(xiàn)膠水對負(fù)載的不利影響。每個樣品都沿著軟骨的中心線縮進(jìn)，以避免邊緣效應(yīng)。為了平均手術(shù)切口和組織不均勻性可能的表面粗糙度效應(yīng)，將每個樣品縮進(jìn)在相距300μm的9個位置以獲得平均數(shù)據(jù)。

   （6）組織學(xué)

   將三個樣品固定在4%福爾馬林中，并嵌入石蠟中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行切片。載玻片用Alcian藍(lán)色或Lawson染色分別描繪糖胺聚糖或彈性蛋白纖維，并拍攝顯微圖像（徠卡DM4000B / DC500;韋茨拉爾， 德國;放大倍率，200×）。

   （7）統(tǒng)計分析

   在降解實驗之前，通過對3個不同耳軟骨樣品的單一位置進(jìn)行10次連續(xù)測量的類內(nèi)相關(guān)系數(shù)（雙向隨機(jī)效應(yīng)）來確定壓痕的再現(xiàn)性。使用類間相關(guān)系數(shù)（ICC）計算降解實驗中單個樣品上單獨壓痕之間的變異性?；谶@些結(jié)果，通過方差檢驗的單變量分析確定了有效楊氏模量的差異。所有分析均使用SPSS統(tǒng)計軟件版本22進(jìn)行。P值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。

三、結(jié)果

    這些實驗的一個重要方面是壓痕協(xié)議的定義，以確保粘彈性效應(yīng)既不影響也不影響卸載曲線。粘彈性效應(yīng)表現(xiàn)為壓痕過程中能量的時間依賴性耗散。18這在應(yīng)力-應(yīng)變曲線中通過加載曲線和卸載曲線之間的面積進(jìn)行可視化。奧利弗和法爾描述的模型17利用卸載曲線的斜率來確定有效的楊氏模量（圖.（圖 1A）。1為了實現(xiàn)這一點，在加載后引入保持期，以使樣品有足夠的時間在卸載樣品之前使能量消散。除此之外，卸載速度保持足夠慢，以使樣品能夠重新調(diào)整到不斷減小的負(fù)載，因為延遲樣品響應(yīng)的累積會對卸載曲線產(chǎn)生不利影響。準(zhǔn)備實驗（數(shù)據(jù)未顯示）表明，2秒負(fù)載，2秒保持和4秒卸載周期足以防止粘彈性效應(yīng)顯著影響卸載曲線（負(fù)載值線性下降，從而可以精確確定曲線角度系數(shù);圖）。圖1A）。1A）.雖然樣品在壓痕深度方面在保持期后仍表現(xiàn)出松弛，但較長的保持期并不表明在*壓痕期間能量耗散的顯著變化。探針直徑的選擇基于組織學(xué)切片，顯示平均山羊耳狀軟骨細(xì)胞直徑約為10μm，而含有2或3個軟骨細(xì)胞的更橢圓形的腔隙最長測量在40μm左右（圖。（圖 2）。2).因此，78μm被認(rèn)為足以測量平均ECM值，同時仍然足夠精細(xì)以提供詳細(xì)信息。文獻(xiàn)中的力學(xué)測試顯示，耳軟骨的楊氏模量范圍為0.8至8 MPa。16以此為參考，選擇了剛度為80 N / m的懸臂，以確保探頭的大部分行程將轉(zhuǎn)化為壓痕深度而不是懸臂彎曲，從而產(chǎn)生7至15μm之間的壓痕深度。

圖 2.

山羊耳朵軟骨橫截面的微觀明場濾波圖像（100×）。平均空隙大小約為40μm（紅色橢圓）。

通過在3個不同樣品上的單個點重復(fù)壓痕來確認(rèn)壓痕系統(tǒng)的可重復(fù)性，ICC為0.99。組織學(xué)證實了糖胺聚糖和彈性蛋白從進(jìn)行壓痕實驗的外圍區(qū)域的處理組織樣品中降解（圖。（圖3）3).

圖 3.

3 個隨機(jī)標(biāo)本（山羊 1、4 和 7）的組織學(xué)圖像 （200×）在 48 小時處染色糖胺聚糖（阿爾西安藍(lán)染色，左部分）和彈性蛋白（勞森染色，右部分）。所有圖像均從橫向樣品側(cè)拍攝，其中進(jìn)行壓痕（每張圖像的頂部），并且最大限度地暴露于酶。兩組對照樣品均顯示強(qiáng)糖胺聚糖或彈性蛋白染色。用透明質(zhì)酸酶或彈性蛋白酶處理的樣品顯示出污漬強(qiáng)度降低，特別是在虛線框所描繪的橫向（縮進(jìn)）區(qū)域。酶滲透和隨后的降解都綽綽有余，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過最大壓痕測量深度（>20μm）。

每個樣品的不同測量結(jié)果具有良好的再現(xiàn)性，ICC平均值為0.9（0.81-0.98）。發(fā)現(xiàn)耳軟骨有效楊氏模量的本地值為5.2 MPa（±0.7）。透明質(zhì)酸酶治療24和48小時后，這些值分別降至2.2 MPa（±0.6）和2.0 MPa（±0.3）。特別是在彈性蛋白酶組中，個體差異差異很大，24小時時平均有效楊氏模量為4.2 MPa（±0.62），48小時后平均有效楊氏模量為3.0 MPa（±0.44）（圖。（圖 4）。4).對照組的加班時間也略有下降，可能是由于自溶過程，但48小時后所有治療組之間均觀察到穩(wěn)定且顯著的差異（P <0.001）（圖5）5).

圖 4.

Young在24小時（左）和48小時（右）下每組不同樣品的模量。Co，控制;Ela，彈性蛋白酶處理組;Hya，透明質(zhì)酸酶治療組。

圖 5.

24小時和48小時降解后樣品組的平均楊氏模量（**P <0.001）。對照組在24小時后顯示初始僵硬喪失，但在48小時時沒有進(jìn)一步下降。彈性蛋白酶處理組（Ela）與透明質(zhì)酸酶處理組（Hya）不同，在酶暴露24小時后沒有顯示出明顯的僵硬損失。在48小時時，與對照組相比，所有治療組的僵硬均顯著降低。

四、討論

    當(dāng)臨床醫(yī)生想到組織工程時，他們往往傾向于只關(guān)注總機(jī)械性能的最終結(jié)果，因為從臨床角度來看，這一方面對手術(shù)成功至關(guān)重要。然而，現(xiàn)在人們越來越認(rèn)識到，許多組織工程植入物由于細(xì)胞的異常行為導(dǎo)致鈣化或變形和再吸收而長期失敗。19優(yōu)化細(xì)胞將遇到的生物力學(xué)環(huán)境可能是指導(dǎo)細(xì)胞分化和基質(zhì)生產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵。測量Young組織和支架模量的細(xì)微差異的能力對于正確微調(diào)細(xì)胞生物力學(xué)微環(huán)境至關(guān)重要。在這項研究中，我們研究了一種能夠在細(xì)胞水平上測量組織硬度的新工具，該工具不僅可以對發(fā)育組織和構(gòu)建體的最終特征進(jìn)行無損評估，還可以對發(fā)育中的組織和構(gòu)建體的起始條件和過程質(zhì)量進(jìn)行無損評估，從而促進(jìn)新型，有效的組織工程方法的開發(fā)。

    我們選擇了“反向組織工程模型"，使用山羊耳朵軟骨作為新鮮材料的一致來源，以證明這項新技術(shù)在測量各種組合物中的組織彈性的適用性。為了探索我們的設(shè)置的適用性和靈敏度，以檢測組織（再）生成過程中組織（再）生成過程中ECM質(zhì)量和組成的細(xì)微差異，以組織剛度為結(jié)果參數(shù)，我們用不同的降解酶處理成熟的彈性軟骨。彈性蛋白或糖胺聚糖的去除導(dǎo)致彈性的顯著普遍降低。然而，彈性蛋白酶消化組的巨大差異令人驚訝。史密斯等人20已經(jīng)注意到，它們在椎間盤環(huán)纖維中酶促降解彈性纖維的廣泛方案不是絕對的。特別是在彈性蛋白酶組中，他們報告了高變異性。他們進(jìn)一步提出，彈性纖維的降解會導(dǎo)致膠原結(jié)構(gòu)的分離和變形。這可以解釋為什么我們在彈性蛋白酶組中發(fā)現(xiàn)了如此大的品種;換句話說，這可能是由于彈性蛋白濃度的變化和隨后動物之間的降解以及剩余膠原基質(zhì)的重排。后者也可以解釋一些樣品的彈性最初略有增加。在一項關(guān)于彈性蛋白酶對豬肉色動脈壁的影響的研究中也觀察到了這種效應(yīng)。21彈性蛋白酶降解與動脈壁腫大有關(guān)，但與硬化或軟化無關(guān)。彈性蛋白纖維改變后ECM的結(jié)構(gòu)變化也被提出是耳朵隨著年齡增長而增大的原因。22

    總之，確定（亞）細(xì)胞水平上的機(jī)械性質(zhì)對于深入了解細(xì)胞外力學(xué)的優(yōu)化至關(guān)重要。我們使用的光機(jī)械傳感器系統(tǒng)提供了一種快速可靠的方法來測量該水平上的軟骨ECM變化。目前，我們正在探索將壓痕系統(tǒng)與光學(xué)相干斷層掃描相結(jié)合的可能性，這將允許在縮進(jìn)時同時可視化組織結(jié)構(gòu)。因此，可以以無創(chuàng)方式辨別不同組織層的硬度。將來，這可能為我們提供一種重要的臨床工具，以確定面部重建中移植或再生組織的質(zhì)量。